Neue technische Enzyme für eine grüne Chemie

Enzyme als Biokatalysatoren bieten für eine nachhaltige chemische Industrie einige Vorteile wie milde Reaktionsbedingungen, biologische Abbaubarkeit, hohe Selektivität und daher geringe Nebenproduktbildung. Das Fraunhofer IGB befasst sich seit mehr als zehn Jahren mit dem Screening nach neuen, industriell nutzbaren Enzymen sowie deren Optimierung und Herstellung. Zahlreiche Projekte mit Firmen der chemischen und pharmazeutischen Industrie wurden bereits erfolgreich bearbeitet.

Identifikation geeigneter Biokatalysatoren für eine nachhaltige Industrie

Enzyme finden bereits breite Anwendung in der Lebensmittelindustrie, der Textilindustrie, der Reinigungs- und Waschmittelindustrie, der Chemieindustrie sowie in der Pharmaindustrie. Für eine steigende Nachhaltigkeit in diesen Industriezweigen werden laufend neue Enzyme mit maßgeschneiderten Eigenschaften gesucht. Der Fokus liegt dabei vor allem auf der Identifizierung von neuen Enzymen mit breitem Substrat- und Produktspektrum, hoher Stabilität gegenüber extremen Temperaturen und pH-Werten sowie gesteigerter Langlebigkeit.

• Identifizierung neuer Enzyme mit gewünschten Eigenschaften, z. B. für die Epoxidierung, Lignin-Modifizierung und Chitin-Monomerisierung. Eingesetzt werden Methoden wie Anreicherungskulturen von Organismen, Metagenomscreening, In-silico-Screening und funktionelle Assays.
  
• Etablierung stabiler, skalierbarer Expressionssysteme mit hohen Ausbeuten, beispielsweise in bakteriellen Systemen wie E. coli und eukaryotischen Systemen wie den Hefen Komagataella pastoris, Kluyveromyces lactis
  
• Herstellung der Enzyme im 1- bis zum 30- Liter-Maßstab am Fraunhofer IGB, Auslegung und Optimierung von Fermentationsstrategie (Batch-, Fed-Batch-, kontinuierliche Prozesse)
  
• Auslegung und Planung von Scale-up-Experimenten für Fermentationen bis 10 m³, Durchführung des Scale-ups am und in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer CBP
  
  

Das Fraunhofer IGB beschäftigt sich mit der Herstellung und Optimierung von Enzymen aus verschiedenen Enzymklassen, darunter vor allem hydrolytische Enzyme wie Lipasen, Phospholipasen und Proteasen, und Oxidoreduktasen wie Dismutasen, Dehydrogenasen und Peroxidasen.

Phospholipase C

Die Phospholipase C (PLC) katalysiert die Hydrolyse von Phospholipiden unter Bildung von Diacylglycerolen und wasserlöslichem Phosphorylethanolamin. PLC wird zur Raffination von Pflanzenölen großtechnisch eingesetzt, um eine schnellere und nahezu vollkommene Phasentrennung zu erreichen.

Lipasen

Lipasen nehmen aufgrund ihrer vielseitigen Einsatzmöglichkeiten ca. 5 % des Weltenzymmarktes ein. Lipasen katalysieren die Hydrolyse von Fetten (Triglyzeride) in Glyzerin und Fettsäuren. Je nach Reaktionsbedingungen können Lipasen weitere Reaktionen katalysieren, wie zum Beispiel Veresterungen, Umesterungen, Alkohollyse, Säurehydrolyse, Aminolyse, Acylierungen, Perhydrolysen und Epoxidierungen.

Proteasen

Proteasen (EC 3.4) gehören zu den wichtigsten Enzymen der Industrie. Ca. 60 Prozent aller weltweit genutzten kommerziellen Enzyme sind Proteasen. In der Industrie werden Proteasen vor allem in der Pharmazie, der Medizin und der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Pflanzen bieten ein weites Spektrum verschiedenster Proteasen mit unterschiedlichsten Eigenschaften. Die Nutzung und Produktion pflanzlicher Proteasen für die Industrie ist jedoch, im Gegensatz zur Herstellung mikrobieller Proteasen, durch die oft niedrigen Ausbeuten und die schwierigen Extraktionsbedingungen eingeschränkt. Durch biotechnologische Verfahren und die rekombinante Herstellung pflanzlicher Enzyme in mikrobiellen Expressionssystemen, wie z. B. Hefen, können pflanzliche Enzyme in großen Mengen für die Industrie zugänglich gemacht werden.

Formaldehyd-Dismutase

Eine Formaldehyd-Dismutase aus Pseudomonas sp., die bereits seit einigen Jahren erfolgreich aus dem Wildtypstamm am Fraunhofer IGB erforscht wurde, besitzt zwar einen Cofaktor, aber auch einen integrierten Mechanismus zur Regenerierung desselbigen, sodass diese Oxidoreduktase gut für großtechnische Prozesse geeignet ist. Das Substrat Formaldehyd sowie die Produkte Methanol und Ameisensäure sind wichtige Plattformchemikalien, die in der chemischen Industrie in großen Mengen verarbeitet werden. Gegenwärtig  beschäftigt sich das Fraunhofer IGB mit der heterologen Expression dieses Enzyms in Escherichia coli . Eine weitere Oxidoreduktase, die Methanol-Dehydrogenase, ist von industrieller Relevanz, da nur wenige Alkohol-Dehydrogenasen deutliche Aktivität gegenüber der Plattformchemikalie Methanol besitzen. Die Arbeiten am Fraunhofer IGB hierzu umfassen die heterologe Expression des Enzyms sowie dessen Immobilisierung und Stabilisierung im Hinblick auf den Einsatz in großtechnischen Prozessen. Gemeinsam mit der Formaldehyd-Dismutase soll dieses Enzym zur Herstellung von Methanol aus Biogas eingesetzt werden.

Peroxidasen

Peroxidasen, ebenfalls den Oxidoreduktasen zugehörig, werden am Fraunhofer IGB hinsichtlich ihrer ligninolytischen Aktivitäten untersucht. Neben Peroxidasen, die von Weißfäulepilzen zum Abbau von Lignin sekretiert werden, beschäftigt sich das Fraunhofer IGB mit neuen bakteriellen Peroxidasen und deren Rolle im Lignin-Abbauprozess. Die bakteriellen Dyp-type Peroxidasen sind eine eigene Klasse der Haem-Peroxidasen und kommen in Pilzen sowie Bakterien vor. Einige dieser Dyp-type Peroxidasen sind vermutlich am Abbau von Lignin beteiligt. Am Fraunhofer IGB werden bakterielle Dyp-type Peroxidasen zunächst im Labormaßstab heterolog in Escherichia coli exprimiert und die Enzymausbeute optimiert. Des Weiteren werden die Enzyme gereinigt und ihre katalytischen Eigenschaften untersucht. Eine spätere Anwendung kann im Bereich der Lignin-Modifizierung oder der Oxidation von aromatischen Substanzen bei der Abwasseraufbereitung liegen.

Chitinasen

Eine weitere Klasse industriell relevanter Enzyme, welche am Fraunhofer IGB hergestellt werden, umfasst die Chitinasen. Diese sollen zur Monomerisierung von Chitin eingesetzt werden, wodurch ein Wertstoffstrom aus dem Abfallstoff Chitin generiert werden soll (siehe Wertstoffherstellung aus Abfallströmen).

Am Fraunhofer IGB identifizieren wir maßgeschneiderte rekombinante Enzyme beispielsweise mit bestimmten Substratspektren oder speziellen katalytischen Eigenschaften für verschiedenste Anwendungen.

Für das Enzymscreening setzen wir einerseits konventionelle Methoden ein, indem wir Mikroorganismen isolieren und anreichern. Hierdurch sollen neue Enzyme in kultivierbaren Organismen gefunden werden. Andererseits spielen auch molekulare Methoden wie das Screening über metagenomische Genbanken eine Rolle, wodurch auch nicht-kultivierbare Mikroorganismen erfasst werden können. Die Metagenombanken dienen als Plattform für die schnelle Identifizierung und Optimierung neuer Enzyme. Eine weitere Strategie zur Identifizierung neuer Enzyme besteht in der systematischen Nutzung von Genominformationen aus Sequenzierungsprojekten (in silico Screening). Grundlage ist dabei die oft vorhandene Ähnlichkeit der Gen-Sequenzen von Enzymen mit ähnlichen Eigenschaften.

Enzyme, die in unseren Laboren bereits hergestellt werden können, werden mittels molekular-evolutiver Techniken für verschiedenste Anwendungen optimiert. Diese können wir in heterologen Systemen von bis zu 30 Litern produzieren und evaluieren. Die Enzymherstellung im großtechnischen Maßstab bis 10 m³ inklusive der Hochskalierung  des Prozesses führen wir in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer CBP  durch.

Das Fraunhofer IGB bietet ein breites Spektrum an technischen Enzymen. Beispiele für am Institut bereits hergestellte technische Enzyme und deren mögliche Anwendungsgebiete sind in der nebenstehenden Tabelle gezeigt.

Für die Phospholipase C wurde am Fraunhofer IGB eine Codon-Optimierung durchgeführt, um hohe Ausbeuten bei deren heterologen Expression in der Hefe Kluyveromyces lactis zu erreichen. Gegenwärtig werden zusätzlich Stamm- und Verfahrensoptimierungen durchgeführt, um die Ausbeuten weiter zu steigern.

Eine pilzliche Lipase, die am Fraunhofer IGB identifiziert wurde, wird gegenwärtig rekombinant in der methylotrophen Hefe Komagataella pastoris (früher Pichia pastoris) exprimiert. Die rekombinante Lipase konnte bereits bis in den 1 m³ Maßstab in der Multifunktionsanlage am Fraunhofer CBP am Chemiestandort Leuna hergestellt werden.

Pflanzliche Proteasen werden am Fraunhofer IGB rekombinant in Hefen exprimiert. Für eine rekombinante Protease konnte bereits eine 1,4 Mal höhere Aktivität im Vergleich zu einem kommerziellen Enzym gemessen werden.

Es wurden die Genome der ligninolytischen Bakterienstämme Streptomyces sp. und Pseudonocardia sp. sequenziert und ein Sequenzabgleich mit Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken durchgeführt. In beiden Stämmen könnten eine Vielzahl von Monooxygenasen und Dioxygensen identifiziert werden, die über die Aromaten-Stoffwechselwege dieser Bakterien Auskunft geben. Zudem wurden drei potentielle ligninolytische Peroxidasen identlifiziert. Eine Dyp-type Peroxidase aus Streptomyces sp. wurde in E. coli  exprimiert und eine Optimierung der Enzymausbeute durchgeführt. Die Peroxidase wurde gereinigt und in Enzym-Assays eine Aktivität gegenüber verschiedener Modellsubstanzen gezeigt.

Um die Formaldehyd-Dismutase rekombinant herstellen zu können, wurde das zugehörige Gen im ersten Schritt aus Pseudomonas sp. isoliert und die Gensequenz analysiert. Vergleiche der IGB-eigenen Dismutase mit einer in der Literatur bekannten ergab eine hohe Übereinstimmung zwischen diesen Genen. Die rekombinante Herstellung der Formaldehyd-Dismutase in verschiedenen E. coli-Stämmen zeigte bereits höhere Ausbeuten bei einfacherer Kultivierung als im Wildtypstamm. Durch die rekombinante Herstellung konnte unter anderem die  Langzeitstabilität der Dismutase deutlich erhöht werden. Derzeit wird an der Prozessoptimierung zur Enzymherstellung und der gezielten Modifikation des Enzyms für eine spätere Immobilisierung gearbeitet.
 

Grumaz C, Rais D, Kirstahler P, Vainshtein Y, Rupp S, Zibek S, Sohn K. 2017. Draft genome sequence of Pseudonocardia autotrophica strain DSM 43083, an efficient producer of peroxidases for lignin modification. Genome announcements, No. 5.  https://doi.org/10.1128/genomeA.01562-16

Blaschke L, Wagner W, Werkmeister C, Wild, M, Gehring A, Rupp S, Zibek S. 2017. Development of a simplified purification method for a novel formaldehyde dismutase variant from Pseudomonas putida J3. in Journal of Biotechnology, Vol. 241, pp. 69-75. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.11.007