Für einen möglichst eindeutigen und spezifischen Nachweis von infektiösen Erregern entwickeln wir am Fraunhofer IGB molekularbiologische diagnostische Verfahren – auf Nukleinsäurebasis (Nachweisverfahren auf Basis der DNA-Hochdurchsatzsequenzierung, Lateral Flow Assay, diagnostische Microarrays) oder mittels zellulärer bzw. immobilisierter Reportersysteme (ImmuStick).
Bei Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation (Next-Generation Sequencing, NGS) können simultan mehrere hundert Millionen Fragmente in einer Probe – und damit das komplette Genom von Organismen innerhalb nur weniger Stunden – sequenziert und mit bekannten Gensequenzen abgeglichen werden.
Das Fraunhofer IGB hat auf der Grundlage dieser Technologien eine alternative Diagnoseplattform für Sepsis entwickelt. Dabei werden Bakterien, Pilze oder Viren direkt über eine Sequenzanalyse ihres Erbguts (DNA, RNA) identifiziert – ohne die Erreger zuvor im Labor kultivieren zu müssen. In klinischen Studien in Kooperation mit dem Universitätsklinikum Heidelberg konnte das Diagnoseverfahren mit Blutproben von Sepsispatienten validiert werden. Dabei lieferte die NGS-Diagnose innerhalb von nur 24 Stunden Aufschluss darüber, mit welchen Erregern die Patienten infiziert waren.
Weitere Vorteile: Enthalten die Proben nicht nur DNA von Bakterien, sondern auch von Viren oder Pilzen, werden diese ebenso sequenziert, analysiert und identifiziert. In der Studie konnte beispielsweise ein viraler Erreger als Krankheitserreger eines Patienten identifiziert werden, der in der auf kultivierbare Bakterien beschränkten Blutkultur des Patienten ein negatives Ergebnis lieferte. Auch die Resistenz von Bakterien gegenüber gebräuchlichen Antibiotika wie Methicillin, Vancomycin oder Tetracyclin wird über entsprechende Resistenzgene vermittelt. Die Hochdurchsatzsequenzierung erlaubt es daher, in der gleichen Analyse nicht nur die biologische Art des Erregers, sondern auch seine Resistenzgene zu identifizieren und bei der Auswahl der Therapie zu berücksichtigen.
Um die Zeit bis zur Diagnose weiter zu verkürzen, untersuchen die Wissenschaftler, wie das Verfahren auf neuere Sequenzierplattformen übertragen werden kann. Mit der neuesten Einzelmolekül-DNA-Sequenziertechnologien der dritten Generation, an deren Erprobung das IGB beteiligt war, kann DNA in noch kürzerer Zeit als bisher sequenziert werden: Wir konnten zeigen, dass die Analyse der mikrobiellen DNA schon während der Sequenzierung möglich ist und sich die Erreger-Identifizierung damit auf sechs bis acht Stunden reduzieren lässt [1].
Somit kann die Zuverlässigkeit der sequenzierbasierten Diagnostik mit dem Geschwindigkeitsvorteil einer Echtzeitanalyse kombiniert werden, um Patienten in Zukunft so rasch wie möglich die optimale antibiotische Therapie zukommen lassen zu können.
[1] Grumaz, C; Hoffmann, A.; Vainshtein, Y.; Kopp, M.; Grumaz, S.; Stevens, P.; Decker, S. O.; Weigand, M. A.; Hofer, S.; Brenner, T.; Sohn, K. (2020) Rapid next generation sequencing-based diagnostics of bacteremia in septic patients. Journal of Molecular Diagnostics 22 (3): 405 DOI: 10.1016/j.jmoldx.2019.12.006
Lateral Flow Assays (LFA) sind chromatographische Schnelltests – ohne aufwendige Infrastruktur durchführbar – und daher als Point‑of‑Care‑Tests (POCT) geeignet. Zu den wohl bekanntesten LFAs gehört der Schwangerschaftstest. Entwicklungsbedarf besteht jedoch bei der Implementierung von nukleinsäurebasierten Nachweisverfahren in ein LFA‑Format.
Am Fraunhofer IGB wurde daher in Kooperation mit dem Leistungszentrum Mass Personalization ein Nucleic Acid Lateral Flow Assay (NALFA) zum Nachweis von Pathogenen etabliert und als Proof of Concept der Nachweis des Herpes‑simplex‑Virus 1 gezeigt. Hierfür wurde die genomische DNA des Virus mittels Polymerase‑Kettenreaktion spezifisch amplifiziert und zur Detektion im LFA modifiziert. Durch Modifikation der Pathogen‑Kopien wird bei der Hybridisierung mit der immobilisierten und komplementären Capture‑DNA ein Farbsignal erzeugt, das dem spezifischen Nachweis dient.
Basierend auf diesen Ergebnissen sind weitere Entwicklungen geplant, die zum einen eine infrastrukturell unabhängige Amplifikation des Pathogengenoms und zum anderen den Nachweis mehrerer Pathogene auf einem Streifen beinhalten. Dadurch soll eine schnelle Vor‑Ort‑Diagnostik von Infektionserregern auch in infrastrukturell schwach entwickelten Regionen geschaffen werden, sodass zeitnah eine spezifische Therapie eingeleitet und einer weiteren Ausbreitung der Erreger entgegengewirkt werden kann.
DNA-Microarrays sind hocheffektive Nachweissysteme für Nukleinsäuren. Mit ihrer Hilfe kann man Infektionserreger nachweisen und diskriminieren. Dies spielt besonders für die Diagnostik von Krankheiten auf DNA-Ebene eine Rolle.
Ein Schwerpunkt am Institut ist die schnelle Identifizierung von Krankheitserregern sowie der Nachweis von Antibiotika-Resistenzen mittels DNA-Array. Seit über 10 Jahren entwickeln wir für Kunden aus Unternehmen, Kliniken und Forschungseinrichtungen individuell und an Indikationen angepasste DNA-Microarrays. Die Infrastruktur im Institut ermöglicht die komplette Herstellung, von der Etablierung der Multiplex-PCR und Amplifikation von Erreger-Targets, dem Sondendesign und der Immobilisierung von Sonden im Kontaktprinting-Verfahren bis hin zur Hybridisierung von Target-DNAs zur fluoreszenzbasierten Identifikation der Erreger.
Das grundlegende Prinzip eines Microarrays ist die geordnete, punktförmige Immobilisierung von bis zu tausenden DNA-Sonden mit definierter Sequenz auf einem festen Träger. Durch die Hybridisierungstechnik können damit die gesuchten Erbinformationen (DNA-Sequenzen), beispielsweise der zu diagnostizierenden Erreger, erkannt werden. Target-Sequenzen von Pathogenen, die in einer Patientenprobe anwesend sind, werden mittels PCR amplifiziert und durch Bindung an spezifische immobilisierte Sonden nachgewiesen. Gleichzeitig vorliegende Sonden, die jeweils für einen bestimmten Erreger spezifisch sind, ermöglichen die parallele Analyse von Erregern bzw. Resistenzen. Auf diese Weise können komplexe Krankheitsursachen in einer einzigen Probe und mit einem diagnostischen Ansatz in wenigen Stunden erfasst und diskriminiert werden.
So haben wir beispielsweise im Rahmen des BMBF-geförderten Projekts Fungal Yeast identification in Kooperation der Firmen Euroimmun, Multi Channel Systems MCS und Bosch sowie dem Herz- und Diabeteszentrum Nordrhein-Westfalen ein vollintegriertes Lab-on-a-Chip-System zur schnellen Bestimmung von ca 50 Hefe- und Schimmelpilz-Infektionen entwickelt. Desweiteren wurde in enger Zusammenarbeit mit der GATC Biotech AG eine DNA-Microarray-Plattform entwickelt, mit der parallel Sepsiserreger (Bakterien und Pilze) als auch deren relevante Resistenzen gegen Antibiotika detektiert und identifiziert werden können. Im Auftrag der Immundiagnostik AG Bensheim haben wir DNA-basierte Microarrays zur hochparallelen Diagnostik von Pilzinfektionen und sexuell übertragbaren Infektionserkrankungen – hervorgerufen durch Pilze, Bakterien, Viren oder Protozoen – entwickelt.
Immunrezeptoren sind ein zentraler Baustein des angeborenen Immunsystems. Wie ihr Name »Pattern-Recognition-Rezeptoren« (PRRs) sagt, erkennen diese Rezeptoren konservierte molekulare Muster infektiöser Erreger und isolierte chemische Strukturen. Eine Stimulation der Rezeptoren durch Bindung eines Erregers bzw. einer Erreger-Komponente führt über die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden und Transkriptionsfaktoren zur Induktion einer Immunantwort. Damit spielen die PRRs eine bedeutende Rolle bei der Pathogenabwehr. Über die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine sind sie aber auch an der Entstehung von pathologischen Prozessen bei akuten und chronischen Entzündungskrankheiten des Menschen beteiligt.
Unter den PRRs stellen die Toll-like-Rezeptoren (TLRs) die größte und bekannteste Familie dar. Mit dem gezielten Einsatz dieser Immunrezeptoren als Sensoren ist es am IGB gelungen, Nachweissysteme für Krankheitserreger und für mikrobielle Bestandteile, z. B. in pharmazeutischen Produkten oder medizintechnischen Apparaten zu entwickeln. Neben zellbasierten Assays wurde mit dem ImmuStick auch ein kompetitiver Immunoassay als Teststreifen für den Nachweis von Pyrogenen mit immobilisierten Immunrezeptoren demonstriert. Die Ganzzell-Biosensor-Assays lassen sich zudem hervorragend zur Detektion mikrobieller Kontaminationen einsetzen. Diese Entwicklung wurde bis zur Patentreife fortgeführt (Patent WO002008003489A8). Auch der Einsatz des ImmuStick-Teststreifens zur Klassifizierung von Sepsis-Erregern direkt am Patienten ist denkbar.
Auf demselben Weg wurden Ganzzell-Biosensor-Assays aufgebaut, mit denen die Identifizierung neuer immunmodulatorischer Moleküle gelingt, die potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Therapie der oben genannten Erkrankungen darstellen. Dieser Ansatz wird im Kapitel »Therapie« beschrieben.
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB