Enzymexpression in Bakterien und Hefen

Für die Herstellung von Enzymen existieren verschiedene Verfahren. Eine Möglichkeit ist der direkte Einsatz von mikrobiellen Isolaten zur Enzymproduktion wie zum Beispiel Weißfäulepilze zur Herstellung ligninolytischer Enzyme oder chitinolytischer Bakterien zur Herstellung von Chitinasen. Viele dieser Mikroorganismen bilden bereits unter den richtigen Kultivierungsbedingungen und ohne gentechnische Modifikationen die gewünschten Enzyme in ausreichender Menge, die direkt oder nach Aufreinigung in industriellen Prozessen einsetzbar sind.

Oftmals produzieren Mikroorganismen jedoch nicht nur das gewünschte Enzym, sondern einen Cocktail an verschiedenen Enzymen. Viele mikrobielle Isolate sind zudem nicht für gentechnische Methoden zugänglich. Dadurch können kaum Optimierungen am Organismus vorgenommen werden, die beispielsweise die Enzymproduktion durch die Überexpression von Faltungshelfern verbessern können. Auch Modifikationen am Enzym sind nur schwierig durchzuführen, die die Aktivität, Spezifität oder Aufreingung optimieren würden (z. B. durch Veränderungen am aktiven Zentrum, oder durch das Anhängen von Affinitäts-Tags). In solchen Fällen kann das gewünschte Enzym heterolog in etablierten, mikrobiellen Produktionsstämmen wie Escherichia coli hergestellt werden.

Die Verfahrensoptimierung zur effizienten Herstellung einiger der genannten Enzyme wurde bereits durchgeführt. Die erzeugte Lipase wurde erfolgreich zur chemo-enzymatischen Epoxierung von Pflanzenölen eingesetzt.

Das Fraunhofer IGB beschäftigt sich sowohl mit der Identifizierung von mikrobiellen Isolaten, die gewünschte Enzyme oder Enzymgemische erzeugen, wie auch mit der Erzeugung von mikrobiellen Produktionsstämmen zur heterolgoen Enzymproduktion. Für die heterologe Enzymproduktion werden prokaryotische Expressionssysteme wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis und eukaryotische Systeme wie die Hefe Kluyveromyces lactis und die methylotrophe Hefe Komagataella pastoris (früher Pichia pastoris ) eingesetzt.

Vorteile einer heterologen Expression

  • Durch die Nutzung starker Promotoren oder durch das Einführen mehrerer Genkopien, die für das gewünschte Enzym kodieren, kann die Genexpression deutlich gesteigert werden.
  • Das gewünschte Enzym kann über induzierbare Promoteren zielgerichtet exprimiert werden, dadurch können Wachstums- und Produktionsphase entkoppelt werden.
  • Zielgerichtete Mutationen sind möglich, um die Aktivität oder Spezifität des Enzyms zu verbessern.
  • Viele Produktionsstämme sind für die Enyzmherstellung optimiert, z. B. für die Produktion von besonders GC-reichen Sequenzen. Protease-defiziente Stämme stehen zudem zur Verfügung, wodurch Ausbeuteverluste durch Abbau des Enzymproduktes während der Kultivierung minimiert werden.
  • Intrazelluläre Enzyme können durch die Verknüpfung mit einer Signalsequenz in das Kulturmedium sekretiert werden. Dadurch ist kein Zellaufschluss mehr nötig und eine erste Aufreinigung des Enzymproduktes erfolgt bereits während der Kultivierung.

Leistungspektrum

  • Rekombinante Herstellung von Perhydrolasen, Lipasen, Peroxidasen, Phospholipasen, Dismutasen, Alkohol-Dehydrogenasen, ligninolytische Enzyme, Chitinasen
  • Identifizierung und Charakterisierung von geeigneten Enzymproduzenten
  • Entwicklung und Optimierung stabiler pro- oder eukaryotischer Expressionssysteme für industrielle Enzyme
  • Verfahrensentwicklung und -optimierung zur Enzymproduktion bis in den Pilotmaßstab (10 m3)

Ziele und Strategien

Unser Ziel ist es, für ausgewählte Enzyme stabile mikrobielle Expressionssysteme zu etablieren und optimierte Verfahren für deren großtechnische Produktion zu erarbeiten. Für die Untersuchung der Enzymherstellung im Labormaßstab stehen am Fraunhofer IGB in Stuttgart mehrere 1-Liter-Parallelfermenter und ein 42-Liter-Bioreaktor mit Methanolsonde zur Kultivierung von K. pastoris zur Verfügung.  Mit der Multifunktionsanlage am Fraunhofer CBP am Chemiestandort Leuna ist eine Hochskalierung (Scale-up) optimierter Prozesse bis in den Pilotmaßstab von 10 m3 möglich. Problematisch bei der Fermentation von K. pastoris ist die Nutzung von Methanol als Induktor zur Proteinexpression. Methanol ist toxisch und leicht entzündlich, weshalb gewisse Sicherheitsanforderungen bei der Fermentation im Großmaßstab gewährleistet werden müssen. Diese Anforderungen wurden bei der Auslegung der Multifunktionsanlage am Fraunhofer CBP explizit berücksichtigt, um Fermentationen von K. pastoris auch im technischen Maßstab durchführen zu können.

Bisherige Ergebnisse und Ausblick

Bereits am Institut hergestellte Enzyme und deren mögliche Anwendungsgebiete.
Bereits am Institut hergestellte Enzyme und deren mögliche Anwendungsgebiete.
Lipase sprühgetrocknet.
Lipase sprühgetrocknet.

Mehrere Enzyme werden bereits am Fraunhofer IGB heterolog in E. coli oder den Hefen K. pastoris und K. lactis exprimiert. Beispiele hierfür finden sich in der nebenstehenden Tabelle. Die Verfahrensoptimierung zur effizienten Herstellung einiger der genannten Enzyme steht derzeit im Fokus aktueller Arbeiten.


Die Expression einer Lipase in K. pastoris konnte bereits am Fraunhofer CBP bis in den 1-m3-Maßstab erfolgreich durchgeführt und mehrere Kilogramm an sprühgetrocknetem oder lyophilisiertem Enzym hergestellt werden. Die erzeugte Lipase wird derzeit zur chemo-enzymatischen Epoxierung von Pflanzenölen untersucht und soll im größeren Maßstab zur Herstellung biobasierter Epoxide eingesetzt werden. Einige der Enzyme werden in verschiedenen E. coli-Systemen hergestellt. Hierbei wurden verschiedene Stämme auf Wachstum und Enzymexpression hin verglichen und der Stamm mit der höchsten Expression ausgewählt. Durch die Variation von Parametern wie Nährmedium, Kohlenstoffquelle, Expressionstemperatur und -dauer sowie Induktionszeitpunkt konnte die Ausbeute an aktivem Enzym weiter gesteigert werden. Ähnliche Optimierungen werden für weitere Enzyme durchgeführt. Außerdem wird die Übertragung dieser Ergebnisse auf Fermentationen zunächst im Labormaßstab und später im Pilotmaßstab bis 10 m3 (Fraunhofer CBP Leuna) durchgeführt.

Publikationen

Werner N, Hirth T, Rupp S, Zibek S. 2015. Expression of a codon-optimized Carica papaya papain sequence in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. in: Journal of Microbial and Biochemical Technology. https://doi:10.4172/1948-5948.1000231

 

Blaschke L, Wagner W, Werkmeister C, Wild, M, Gehring A, Rupp S, Zibek S. 2017. Development of a simplified purification method for a novel formaldehyde dismutase variant from Pseudomonas putida J3. in Journal of Biotechnology, Vol. 241, pp. 69-75. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.11.007